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Mentre i mietitori stanno riposando all'ombra, la loro fittavola Adina legge in disparte un libro che narra la storia di Tristano e Isotta. Intanto, il contadino povero Nemorino la osserva ed esprime per lei tutto il suo amore e la sua ammirazione, dolendosi della propria incapacità di conquistarla (Quanto è bella, quanto è cara). I contadini chiedono ad Adina di leggere ad alta voce e lei riferisce la storia di Tristano che, innamorato della regina Isotta, ricorre a un filtro magico che lo aiuta ad attirare il suo affetto e la sua fedeltà (Della crudele Isotta).

Mentre Nemorino sogna di trovare questo magico elisir, arriva al paese il sergente Belcore con lo scopo di arruolare nuove leve. Egli corteggia Adina e le propone di sposarlo (Come Paride vezzoso), ma la bella fittaiuola risponde di volerci pensare un po'. Segue un duetto tra Adina e Nemorino in cui la donna espone la sua teoria sull'amore: l'amore fedele e costante non fa per lei (Chiedi all'aura lusinghiera).

Arriva poi il dottor Dulcamara, un truffatore, che, spacciandosi per medico di grande fama, sfoggia alla gente i propri portentosi preparati (Udite, udite, o rustici): Nemorino gli chiede se per caso abbia l'elisir che fa innamorare e il ciarlatano gli offre per uno zecchino una bottiglia di vino bordeaux, spiegando che l'effetto si farà sentire dopo un giorno (quando egli sarà già lontano da quel villaggio). Nemorino beve l'elisir e si ubriaca: ciò lo fa diventare disinvolto quel tanto che basta per mostrarsi indifferente nei confronti di Adina, che subito prova un certo fastidio, abituata com'è a sentirsi desiderata.

Adina, per vendicarsi dell'indifferenza di Nemorino, accetta di sposare il sergente Belcore, che però dovrà partire il giorno dopo; pertanto, le nozze vengono fissate per il giorno stesso. Nemorino cerca di convincere Adina ad attendere fino al giorno successivo (lui sa che solo il giorno dopo avrà effetto l'elisir), ma Adina se ne va con Belcore.

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Fervono i preparativi per le nozze. Dulcamara e Adina improvvisano una barcarola a due voci (Io son ricco e tu sei bella). Quando giunge il notaio, Adina dice di voler aspettare la sera, perché vuole sposarsi in presenza di Nemorino, per punirlo della sua indifferenza. Nemorino vuole comperare un'altra bottiglia di elisir ma non avendo più denaro si arruola tra i soldati di Belcore per avere la paga (Ai perigli della guerra). Belcore così ottiene di allontanare il suo rivale.

Nel frattempo, però, Giannetta sparge la notizia che Nemorino ha ottenuto una grande eredità da uno zio deceduto da poco (Saria possibile?). Questo non lo sanno né l'interessato, né Adina, né Dulcamara: la notizia fa sì che le ragazze del paese incomincino a corteggiare Nemorino, il quale per parte sua pensa sia l'effetto dell'elisir. A vedere quel che succede, Dulcamara resta sbigottito, e comincia a pensare che il suo elisir faccia realmente effetto, mentre Adina si ingelosisce.

Dulcamara le racconta di aver venduto a Nemorino l'elisir e lei capisce di essere da lui amata (Quanto amore! Ed io spietata). Nemorino gioisce quando si accorge di una lacrima negli occhi di Adina, che gli rivela che anche la ragazza lo ama (Una furtiva lagrima). Adina riacquista il contratto di arruolamento di Nemorino e glielo consegna, invitandolo a restare nel paese. Nemorino è deluso, vorrebbe una dichiarazione d'amore che non arriva e allora dichiara di volersene andare: solo allora Adina cede e dichiara di amarlo (Prendi, per me sei libero). Belcore si consola in fretta del matrimonio sfumato, affermando che in un altro paese troverà qualche altra ragazza da corteggiare, mentre Dulcamara parte dal paese di Nemorino tutto gongolante per il successo del suo elisir (Ei corregge ogni difetto).